Λύσεις — Κεφάλαιο 15 (Ερωτήσεις σελ. 192) – ΑΝΟΣΟΛΟΓΙΑ Γ΄ ΕΠΑΛ
Λύσεις — Κεφάλαιο 15 (Ερωτήσεις σελ. 192)
Απαντήσεις στις 16 ερωτήσεις του κεφαλαίου 15.
Ερώτηση 1 — Ανοσοφθορισμός
Ερώτηση: Τι ονομάζουμε ανοσοφθορισμό;
Απάντηση:
- Ανοσοφθορισμός είναι η μέθοδος ανίχνευσης αντιγόνων ή αντισωμάτων σε βιολογικά υλικά με τη χρήση αντισωμάτων σεσημασμένων με φθορίζουσες χρωστικές. Χρησιμοποιείται για τον in situ (επί τόπου) εντοπισμό μιας πρωτεΐνης σε ένα κύτταρο ή ιστό. Είναι απλή στην εφαρμογή της, παρουσιάζει μεγάλη επαναληψιμότητα και χρησιμοποιείται τόσο για ερευνητικούς όσο και για διαγνωστικούς σκοπούς (π.χ. ανίχνευση αντιπυρηνικών αντισωμάτων — έμμεσος ανοσοφθορισμός σε Hep-2 κύτταρα, κεφ. 9). Η σήμανση αντισωμάτων με φθορίζουσες χρωστικές πρωτοπαρουσιάστηκε από τον Coons το 1941. Τα παρασκευάσματα εξετάζονται σε ειδικό μικροσκόπιο φθορισμού. Διακρίνεται σε άμεσο και έμμεσο ανοσοφθορισμό (σελ. 177-178).
Σύνοψη: (ενδεικτική) Μέθοδος ανίχνευσης αντιγόνων ή αντισωμάτων σε βιολογικά υλικά με αντισώματα σεσημασμένα με φθορίζουσες χρωστικές — in situ εντοπισμός πρωτεΐνης σε κύτταρο/ιστό, με μικροσκόπιο φθορισμού (Coons 1941)· άμεσος και έμμεσος.
Κριτήρια αξιολόγησης:
Ερώτηση 2 — Φθορισμός
Ερώτηση: Δώστε τον ορισμό του φθορισμού.
Απάντηση:
- Φθορισμός ονομάζεται το φαινόμενο της εκπομπής δευτερεύουσας φωτεινής ακτινοβολίας από ένα διεγερμένο μόριο: το μόριο της φθορίζουσας χρωστικής απορροφά ακτινοβολία (διεγείρεται) και εκπέμπει φως διαφορετικού (μεγαλύτερου) μήκους κύματος, το οποίο γίνεται ορατό στο μικροσκόπιο φθορισμού. Οι φθορίζουσες χρωστικές χρησιμοποιούνται για τη σήμανση αντισωμάτων (π.χ. FITC, PE), ώστε το σύμπλεγμα αντιγόνου-αντισώματος να εντοπίζεται ως φθορίζουσα περιοχή στη θέση του αντιγόνου (ανοσοφθορισμός) ή να μετριέται στο κυτταρόμετρο ροής (σελ. 177).
Σύνοψη: (ενδεικτική) Φθορισμός = εκπομπή δευτερεύουσας φωτεινής ακτινοβολίας από ένα διεγερμένο μόριο· οι φθορίζουσες χρωστικές χρησιμεύουν για σήμανση αντισωμάτων.
Κριτήρια αξιολόγησης:
Ερώτηση 3 — Άμεσος – έμμεσος
Ερώτηση: Σε ποιες κατηγορίες διακρίνονται οι τεχνικές του ανοσοφθορισμού; Ποια από τις δύο κατηγορίες είναι πιο αποτελεσματική;
Απάντηση:
-
Οι τεχνικές του ανοσοφθορισμού διακρίνονται σε δύο κατηγορίες (σελ. 177-178, εικ. 15.1):
- Άμεσος ανοσοφθορισμός: η φθορίζουσα χρωστική προσδένεται άμεσα στο ειδικό αντίσωμα, το οποίο εφαρμόζεται στην τομή ή στα μονιμοποιημένα κύτταρα, σχηματίζοντας φθορίζον σύμπλεγμα εντοπισμένο στη θέση του αντιγόνου.
- Έμμεσος ανοσοφθορισμός: χρησιμοποιούμε μη επισημασμένο αντίσωμα έναντι του αντιγόνου που εξετάζουμε και στη συνέχεια προσθέτουμε δεύτερο αντίσωμα σημασμένο με φθορίζουσα χρωστική, το οποίο έχει ειδικότητα έναντι της σταθερής περιοχής του πρώτου αντισώματος. Διαδικασία: μονόστιβα κυττάρων σε αντικειμενοφόρους → μονιμοποίηση με φορμαλδεΰδη → επώαση με το πρώτο αντίσωμα → επώαση με το δεύτερο, φθορίζον αντίσωμα → μικροσκόπιο φθορισμού. Παραλλαγή: έμμεσος ανοσοφθορισμός ενισχυμένος από συμπλήρωμα.
Πιο αποτελεσματικός είναι ο έμμεσος: το αποτέλεσμα είναι η ενίσχυση του σήματος φθορισμού, γιατί σε κάθε δεσμευμένο πρώτο αντίσωμα προσδένονται περισσότερα από ένα φθορίζοντα αντισώματα, με συνέπεια την αύξηση της ευαισθησίας της μεθόδου (και χρήση ενός κοινού φθορίζοντος αντι-ανοσοσφαιρινικού αντισώματος για πολλά πρώτα αντισώματα).
Σύνοψη: (ενδεικτική) Άμεσος (η χρωστική δένεται απευθείας στο ειδικό αντίσωμα) και έμμεσος (μη επισημασμένο πρώτο αντίσωμα + φθορίζον δεύτερο αντίσωμα κατά της σταθερής περιοχής του)· πιο αποτελεσματικός ο έμμεσος — ενίσχυση σήματος (πολλά φθορίζοντα ανά πρώτο αντίσωμα) → μεγαλύτερη ευαισθησία.
Κριτήρια αξιολόγησης:
Ερώτηση 4 — Αρχή RIA
Ερώτηση: Ποια η αρχή λειτουργίας της ραδιοανοσολογικής μεθόδου (RIA);
Απάντηση:
- Η ραδιοανοσολογική μέθοδος (RIA) είναι απλή, ευαίσθητη, με υψηλή ακρίβεια και εξαιρετικά οικονομική. Αρχή της μεθόδου είναι η ανταγωνιστική τεχνική ή μέθοδος του περιορισμένου αντιδραστηρίου: χρησιμοποιούμε ραδιενεργά επισημασμένο αντιγόνο, το οποίο ανταγωνίζεται με το προς μέτρηση (μη επισημασμένο ή «ψυχρό») αντιγόνο για την πρόσδεση σε περιορισμένη ποσότητα του αντίστοιχου αντισώματος. Όσο περισσότερο είναι ποσοτικά το «ψυχρό» αντιγόνο, τόσο λιγότερο επισημασμένο αντιγόνο θα προσδένεται στο αντίσωμα και τόσο ασθενέστερο θα είναι το σήμα — και αντίστροφα. Το μη επισημασμένο αντιγόνο είναι είτε πρότυπο διάλυμα (για την κατασκευή της πρότυπης καμπύλης) είτε το προς εξέταση δείγμα· η ραδιενέργεια του συμπλόκου σημασμένου αντιγόνου-αντισώματος μετριέται σε μετρητή ακτινοβολίας γ (εικ. 15.2-15.4). Πρωτοχρησιμοποιήθηκε από τους Yalow και Berson (1959, Nobel 1977) για τη μέτρηση της ινσουλίνης. Η χρήση ραδιενεργών απαιτεί μέτρα προστασίας: προκαθορισμένος χώρος περιορισμένης πρόσβασης, γάντια μιας χρήσης-ποδιά-πλύσιμο χεριών, απόρριψη καταλοίπων σε προκαθορισμένους χώρους κατά τους κανονισμούς (σελ. 177-181).
Σύνοψη: (ενδεικτική) Ανταγωνιστική τεχνική (περιορισμένου αντιδραστηρίου): ραδιενεργά σημασμένο αντιγόνο ανταγωνίζεται το «ψυχρό» αντιγόνο του δείγματος για περιορισμένη ποσότητα αντισώματος — όσο περισσότερο ψυχρό αντιγόνο, τόσο ασθενέστερο σήμα· πρότυπη καμπύλη, μετρητής γ· μέτρα ακτινοπροστασίας.
Κριτήρια αξιολόγησης:
Ερώτηση 5 — Αρχή ELISA
Ερώτηση: Ποια η αρχή λειτουργίας της ανοσοενζυμικής μεθόδου (ELISA);
Απάντηση:
-
Η ανοσοενζυμική μέθοδος (ELISA) είναι η πιο πρόσφατη μέθοδος προσδιορισμού του συμπλέγματος αντιγόνου-αντισώματος: απλή στην εκτέλεση, με μεγάλη ευαισθησία και ακρίβεια, χωρίς ειδικό εξοπλισμό (εκτός από φωτόμετρο με κατάλληλα φίλτρα) και με μεγάλο αριθμό προτυποποιημένων kit. Αρχή (σελ. 181):
- Ανίχνευση του συμπλέγματος αντιγόνου-αντισώματος (ή ακινητοποιημένου αντισώματος) με τη χρήση αντισώματος ομοιοπολικά συνδεδεμένου με ένζυμο.
- Το ένζυμο, με την προσθήκη του κατάλληλου χρωμογόνου υποστρώματος (άχρωμου), καταλύει την αντίδραση που καταλήγει στον σχηματισμό έγχρωμου προϊόντος.
- Η ποσότητα του χρώματος (άρα και του προϊόντος) είναι ανάλογη της συγκέντρωσης του ενζύμου — δηλαδή του δεσμευμένου επισημασμένου αντισώματος — και μετριέται φωτομετρικά.
Τα συνηθέστερα ένζυμα είναι η αλκαλική φωσφατάση, η υπεροξειδάση του ραπανιού και η β-γαλακτοσιδάση, με υποστρώματα τη φωσφορική π-νιτροφαινόλη και το υπεροξείδιο του υδρογόνου· η ενζυμική αντίδραση διαρκεί 10-30 λεπτά. Πρώτη χρήση ενζύμων: Avrameas-Uriel και Nakane-Pierce, 1966.
Σύνοψη: (ενδεικτική) Ανίχνευση του συμπλέγματος Ag-Ab (ή ακινητοποιημένου αντισώματος) με αντίσωμα ομοιοπολικά συνδεδεμένο με ένζυμο· το ένζυμο μετατρέπει άχρωμο χρωμογόνο υπόστρωμα σε έγχρωμο προϊόν, με χρώμα ανάλογο της συγκέντρωσης του ενζύμου (φωτόμετρο)· ένζυμα: αλκαλική φωσφατάση, υπεροξειδάση ραπανιού, β-γαλακτοσιδάση, 10-30΄.
Κριτήρια αξιολόγησης:
Ερώτηση 6 — Κατηγορίες ELISA
Ερώτηση: Σε ποιες κατηγορίες διακρίνονται οι ανοσοενζυμικές μέθοδοι (ELISA);
Απάντηση:
- Οι ανοσοενζυμικές μέθοδοι διακρίνονται σε (σελ. 181-183):
- Ανταγωνιστικές: όπως στη ραδιοανοσοανάλυση (RIA) — η αρχή λειτουργίας είναι ίδια με τη RIA, με την εξαίρεση ότι το αντιγόνο σημαίνεται με ένζυμο αντί για ραδιοϊσότοπο· το σημασμένο αντιγόνο ανταγωνίζεται το αντιγόνο του δείγματος για περιορισμένο αντίσωμα (όσο περισσότερο αντιγόνο, τόσο λιγότερο σήμα) (εικ. 15.5).
- Μη ανταγωνιστικές (μέθοδος sandwich — ανοσοαναλύσεις δύο θέσεων): χρησιμοποιούνται δύο αντισώματα, ένα επισημασμένο και ένα μη επισημασμένο, ανεπτυγμένα έναντι δύο διαφορετικών επιτόπων της προσδιοριζόμενης ουσίας, τα οποία παγιδεύουν το μετρούμενο μόριο υπό μορφή «sandwich»· σε αντίθεση με την ανταγωνιστική, όσο μεγαλύτερη η συγκέντρωση του αντιγόνου, τόσο περισσότερο επισημασμένο αντίσωμα δεσμεύεται (εικ. 15.6-15.7, διπλό sandwich).
- Άλλη μορφή μη ανταγωνιστικής, για τον προσδιορισμό τίτλου αντισωμάτων: το προς μέτρηση αντίσωμα συνδέεται με το (ακινητοποιημένο) αντιγόνο και στη συνέχεια στο ανοσοσύμπλεγμα συνδέεται επισημασμένο αντίσωμα έναντι του προς μέτρηση αντισώματος (έμμεση ELISA).
Σύνοψη: (ενδεικτική) Ανταγωνιστικές (όπως RIA, αντιγόνο σημασμένο με ένζυμο — σήμα αντιστρόφως ανάλογο) και μη ανταγωνιστικές/sandwich δύο θέσεων (δύο αντισώματα κατά δύο επιτόπων — σήμα ανάλογο του αντιγόνου)· παραλλαγή για τίτλο αντισωμάτων με επισημασμένο αντι-αντίσωμα.
Κριτήρια αξιολόγησης:
Ερώτηση 7 — Πλεονεκτήματα νεφελομετρίας
Ερώτηση: Ποια τα πλεονεκτήματα της νεφελομετρίας;
Απάντηση:
- Η νεφελομετρία (μέτρηση της σκέδασης του φωτός από τα ανοσοσυμπλέγματα σε διάλυμα) προσφέρει μια σειρά πλεονεκτημάτων (σελ. 185): η ευκολία χρήσης των αυτόματων αναλυτών (νεφελομέτρων), η μεγάλη ακρίβεια της μεθόδου και η υψηλή ταχύτητα μετρήσεων μεγάλου αριθμού δειγμάτων. Είναι ακριβής, ταχεία, εύκολη στην εφαρμογή της, έχει καλή ευαισθησία και ειδικότητα, δυνατότητα μέτρησης χαμηλών συγκεντρώσεων και είναι αυτοματοποιημένη. Γι' αυτό χρησιμοποιείται ευρύτατα για τον ποσοτικό προσδιορισμό των ανοσοσφαιρινών IgG, IgA, IgM, της CRP, του RF και των παραγόντων του συμπληρώματος (και για παράγοντες πήξης, φάρμακα, ορμόνες), και έχει αντικαταστήσει τη Mancini και τις μεθόδους latex ως μέθοδος εκλογής.
Σύνοψη: (ενδεικτική) Ευκολία αυτόματων αναλυτών, μεγάλη ακρίβεια, υψηλή ταχύτητα πολλών δειγμάτων· ακριβής, ταχεία, εύκολη, καλή ευαισθησία-ειδικότητα, μέτρηση χαμηλών συγκεντρώσεων, αυτοματοποιημένη — μέθοδος εκλογής για IgG/IgA/IgM, CRP, RF, συμπλήρωμα.
Κριτήρια αξιολόγησης:
Ερώτηση 8 — Καμπύλη αναφοράς νεφελομετρίας
Ερώτηση: Να περιγράψετε την καμπύλη αναφοράς των νεφελομετρικών προσδιορισμών.
Απάντηση:
- Για να γίνουν νεφελομετρικοί προσδιορισμοί στο νεφελόμετρο είναι απαραίτητο να χρησιμοποιήσουμε πρότυπα διαλύματα γνωστής συγκέντρωσης της προσδιοριζόμενης πρωτεΐνης, για τη δημιουργία καμπύλης αναφοράς. Η καμπύλη αναφοράς είναι συνάρτηση της έντασης του σκεδασμένου φωτός (Is) και της συγκέντρωσης των πρωτεϊνών: στον οριζόντιο άξονα η συγκέντρωση των πρότυπων διαλυμάτων και στον κατακόρυφο η ένταση του σκεδαζόμενου φωτός που μετρά το όργανο για καθένα (εικ. 15.8). Επειδή το ποσοστό του σκεδαζόμενου φωτός από τα συμπλέγματα αντιγόνου-αντισώματος είναι ανάλογο με τη συγκέντρωση της ουσίας, η καμπύλη είναι αύξουσα· μετρώντας την ένταση Is του άγνωστου δείγματος και ανατρέχοντας στην καμπύλη, υπολογίζεται η συγκέντρωσή του (σελ. 184-185).
Σύνοψη: (ενδεικτική) Κατασκευάζεται με πρότυπα διαλύματα γνωστής συγκέντρωσης: συνάρτηση της έντασης του σκεδασμένου φωτός (Is) προς τη συγκέντρωση πρωτεΐνης (αύξουσα, αφού η σκέδαση είναι ανάλογη της συγκέντρωσης)· από την Is του δείγματος προκύπτει η συγκέντρωσή του.
Κριτήρια αξιολόγησης:
Ερώτηση 9 — Θολερομετρία
Ερώτηση: Ποια η αρχή λειτουργίας της θολερομετρίας και ποιες οι εφαρμογές της;
Απάντηση:
-
Η θολερομετρία χρησιμοποιείται, όπως και η νεφελομετρία, για την εκτίμηση της συγκέντρωσης των πρωτεϊνών σε βιολογικά υγρά. Αρχή: σε αυτή την περίπτωση μετράμε τη μείωση της έντασης του προσπίπτοντος φωτός κατά τη διέλευσή του από το διάλυμα των συμπλεγμάτων πρωτεΐνης-αντιορού (απορρόφηση/απόσβεση από τη θολερότητα), αντί για το σκεδαζόμενο φως που μετρά η νεφελομετρία.
Εφαρμογές: προσδιορισμός πρωτεϊνών (όπως η νεφελομετρία), και επίσης μέτρηση της δραστικότητας των αντιβιοτικών, βιταμινών κ.λπ.: χρησιμοποιούμε καλλιέργειες βακτηρίων στις οποίες προσθέτουμε σε κατάλληλες αραιώσεις τα αντιβιοτικά που μελετούμε — όσο μεγαλύτερη η θολερότητα (που οφείλεται στη βακτηριακή ανάπτυξη) τόσο μικρότερη η δραστικότητα του αντιβιοτικού. Η ευαισθησία της είναι περίπου ίδια με της νεφελομετρίας, γι' αυτό χρησιμοποιείται εξίσου στην καθημερινή εργαστηριακή πρακτική (σελ. 185).
Σύνοψη: (ενδεικτική) Αρχή: μέτρηση της μείωσης της έντασης του προσπίπτοντος φωτός κατά τη διέλευση από το διάλυμα συμπλεγμάτων πρωτεΐνης-αντιορού· εφαρμογές: συγκέντρωση πρωτεϊνών, δραστικότητα αντιβιοτικών-βιταμινών σε βακτηριακές καλλιέργειες (↑ θολερότητα = ↓ δραστικότητα)· ευαισθησία ≈ νεφελομετρίας.
Κριτήρια αξιολόγησης:
Ερώτηση 10 — PCR — αρχή, εφαρμογές
Ερώτηση: Ποια η αρχή λειτουργίας της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης (PCR) και ποιες οι εφαρμογές της;
Απάντηση:
-
Η PCR πρωτοπαρουσιάστηκε το 1985 από τον K. Mullis (Nobel Χημείας 1993) και είναι η πιο δημοφιλής τεχνική της Μοριακής Βιολογίας. Αρχή: το DNA στόχος αποτελεί το πρότυπο DNA, το οποίο πολλαπλασιάζεται με ενζυμικό τρόπο (in vitro αντιγραφή) σε σημείο που να είναι πλέον ανιχνεύσιμο και εκμεταλλεύσιμο για οποιονδήποτε σκοπό. Αυτό γίνεται με επαναλαμβανόμενους θερμικούς κύκλους τριών σταδίων — αποδιάταξη του δίκλωνου DNA, σύνδεση εκκινητών (primers) στα άκρα της αλληλουχίας στόχου, επιμήκυνση από την Taq πολυμεράση με ελεύθερα δεοξυριβονουκλεοτίδια — και σε κάθε κύκλο διπλασιάζεται η ποσότητα του DNA: το τμήμα-στόχος πολλαπλασιάζεται 2ⁿ (n = κύκλοι)· με 25-40 κύκλους (40 κύκλοι → πάνω από 1 δισεκατομμύριο αντίγραφα) το προϊόν είναι πολλαπλά αντίγραφα του αρχικού DNA (εικ. 15.9-15.10). Στα σύγχρονα εργαστήρια η διαδικασία είναι αυτοματοποιημένη — προσθήκη αντιδραστηρίων σε ειδική συσκευή, τον θερμικό κυκλοποιητή.
Εφαρμογές: πάρα πολλές — στην Ιατρική για τη διάγνωση ασθενειών (π.χ. λοιμώξεων με ανίχνευση DNA/RNA μικροοργανισμών) και γενετικών ανωμαλιών, στην HLA γονιδιακή τυποποίηση (PCR-SSO, PCR-SSP — κεφ. 17), και στην Εγκληματολογία για τη διαλεύκανση υποθέσεων (σελ. 185-187).
Σύνοψη: (ενδεικτική) Αρχή: ενζυμικός πολλαπλασιασμός (in vitro αντιγραφή) του DNA στόχου με επαναλαμβανόμενους κύκλους (αποδιάταξη, σύνδεση εκκινητών, επιμήκυνση με Taq) — κάθε κύκλος διπλασιάζει το DNA (2ⁿ, 25-40 κύκλοι, > 1 δισ. αντίγραφα), σε θερμικό κυκλοποιητή (Mullis 1985)· εφαρμογές: διάγνωση ασθενειών-γενετικών ανωμαλιών, HLA τυποποίηση, εγκληματολογία.
Κριτήρια αξιολόγησης:
Ερώτηση 11 — Στάδια κύκλου PCR
Ερώτηση: Από ποια στάδια αποτελείται ένας κύκλος της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης (PCR);
Απάντηση:
-
Ένας κύκλος της PCR αποτελείται από τρία στάδια (σελ. 186, εικ. 15.9):
- Αποδιάταξη του DNA στόχου: μετατροπή του δίκλωνου μορίου DNA σε μονόκλωνο (με θέρμανση σε υψηλή θερμοκρασία, ≈ 94-95 °C, που σπάει τους δεσμούς υδρογόνου των δύο αλυσίδων).
- Σύνδεση των μονόκλωνων τμημάτων με εκκινητές (primers): ένα ζεύγος συνθετικών ολιγονουκλεοτιδίων, συμπληρωματικών προς τα άκρα της αλληλουχίας στόχου, υβριδίζεται με τις μονόκλωνες αλυσίδες (σε χαμηλότερη θερμοκρασία).
- Επιμήκυνση των νέων αλυσίδων με τη δράση του ενζύμου Taq πολυμεράση (DNA πολυμεράση από το βακτήριο Thermus aquaticus, που διατηρεί τη δράση της σε υψηλές θερμοκρασίες) και των ελεύθερων δεοξυριβονουκλεοτιδίων, τα οποία προσδένονται συμπληρωματικά προς την αρχική αλυσίδα, σχηματίζοντας δύο νέα δίκλωνα μόρια DNA.
Η εναλλαγή των τριών σταδίων αποτελεί έναν κύκλο, κατά τον οποίο διπλασιάζεται η ποσότητα του DNA· συνήθως απαιτούνται 25-40 κύκλοι στον θερμικό κυκλοποιητή.
Σύνοψη: (ενδεικτική) 1. Αποδιάταξη (δίκλωνο → μονόκλωνο DNA με θέρμανση), 2. σύνδεση εκκινητών-primers (ζεύγος ολιγονουκλεοτιδίων συμπληρωματικών προς τα άκρα του στόχου), 3. επιμήκυνση με Taq πολυμεράση (Thermus aquaticus, θερμοανθεκτική) και δεοξυριβονουκλεοτίδια → 2 νέα δίκλωνα μόρια· κάθε κύκλος διπλασιάζει το DNA, 25-40 κύκλοι.
Κριτήρια αξιολόγησης:
Ερώτηση 12 — Εκκινητές
Ερώτηση: Τι ονομάζουμε εκκινητές;
Απάντηση:
- Εκκινητές (primers) ονομάζουμε ένα ζεύγος συνθετικών ολιγονουκλεοτιδίων (μικρών μονόκλωνων τμημάτων DNA) συμπληρωματικών προς τα άκρα της αλληλουχίας στόχου του DNA. Στο δεύτερο στάδιο κάθε κύκλου της PCR συνδέονται (υβριδίζονται) με τα μονόκλωνα τμήματα του αποδιαταγμένου DNA, το ένα σε κάθε αλυσίδα, οριοθετώντας το τμήμα που θα πολλαπλασιαστεί και προσφέροντας το ελεύθερο 3΄ άκρο από το οποίο ξεκινά (εκκινεί) η Taq πολυμεράση την επιμήκυνση της νέας αλυσίδας με τα ελεύθερα δεοξυριβονουκλεοτίδια. Η ειδικότητα των εκκινητών καθορίζει ποιο ακριβώς τμήμα DNA ενισχύεται — στην HLA τυποποίηση χρησιμοποιούνται εκκινητές ειδικής αλληλουχίας (PCR-SSP) (σελ. 186, 208).
Σύνοψη: (ενδεικτική) Εκκινητές (primers) = ζεύγος συνθετικών ολιγονουκλεοτιδίων συμπληρωματικών προς τα άκρα της αλληλουχίας στόχου, που συνδέονται στις μονόκλωνες αλυσίδες και από αυτούς ξεκινά η Taq πολυμεράση την επιμήκυνση· καθορίζουν ποιο τμήμα ενισχύεται.
Κριτήρια αξιολόγησης:
Ερώτηση 13 — Western Blot
Ερώτηση: Τι είναι το ανοσοαποτύπωμα (Western Blot);
Απάντηση:
- Το ανοσοαποτύπωμα (Western Blot) είναι μέθοδος με την οποία μπορούμε να πιστοποιήσουμε την ύπαρξη μιας οποιασδήποτε πρωτεΐνης, αρκεί να έχουμε αντισώματα έναντι αυτής. Πρόκειται για μέθοδο ποιοτικού προσδιορισμού που εφαρμόζεται μόνο σε πρωτεΐνες. Η τεχνική περιλαμβάνει την ηλεκτροφορητική ανάλυση του αντιγονικού δείγματος (διαχωρισμός των πρωτεϊνών σε πήκτωμα) και τη μεταφορά των πρωτεϊνών σε φίλτρο-μεμβράνη νιτροκυτταρίνης, νάυλον ή PVDF, που προσροφά τις πρωτεΐνες ώστε να εμφανίζεται το ακριβές «αποτύπωμα» τους όπως διαχωρίστηκαν στο πήκτωμα· στη συνέχεια η μεμβράνη επωάζεται με το ειδικό αντίσωμα και με δεύτερο αντίσωμα συνδεδεμένο με ένζυμο (υπεροξειδάση), και με προσθήκη υποστρώματος παράγεται έγχρωμο προϊόν στις θέσεις της πρωτεΐνης (ή χημειοφωταύγεια ECL). Χρησιμοποιείται κλινικά κυρίως για τη διάγνωση ερπητικών λοιμώξεων και του AIDS (εικ. 15.11-15.13, σελ. 187-189).
Σύνοψη: (ενδεικτική) Ποιοτική μέθοδος πιστοποίησης της ύπαρξης οποιασδήποτε πρωτεΐνης (μόνο πρωτεΐνες) με ειδικό αντίσωμα: ηλεκτροφόρηση → μεταφορά σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης/νάυλον/PVDF («αποτύπωμα») → αντίσωμα + δεύτερο ένζυμο-συνδεδεμένο αντίσωμα → έγχρωμο προϊόν/ECL· διάγνωση έρπητα, AIDS.
Κριτήρια αξιολόγησης:
Ερώτηση 14 — Στάδια Western Blot
Ερώτηση: Περιγράψτε τα στάδια του ανοσοαποτυπώματος (Western Blot).
Απάντηση:
- Τα στάδια του ανοσοαποτυπώματος (εικ. 15.11-15.13, σελ. 187-189):
- Ηλεκτροφορητική ανάλυση του αντιγονικού δείγματος: οι πρωτεΐνες διαχωρίζονται σε πήκτωμα ανάλογα με το μοριακό τους βάρος/κινητικότητα.
- Μεταφορά (blotting) των πρωτεϊνών από το πήκτωμα σε φίλτρο-μεμβράνη νιτροκυτταρίνης, νάυλον ή PVDF· οι μεμβράνες προσροφούν τις πρωτεΐνες και εμφανίζεται το ακριβές αποτύπωμα τους όπως είχαν διαχωριστεί.
- Επώαση της μεμβράνης με το αντίσωμα έναντι της πρωτεΐνης που θέλουμε να προσδιορίσουμε (πρώτο αντίσωμα) — ή, στη διαγνωστική χρήση, με τον ορό του ασθενούς του οποίου τα αντισώματα αναζητούμε.
- Επώαση με δεύτερο αντίσωμα (κατά του πρώτου) συνδεδεμένο ομοιοπολικά με το ένζυμο υπεροξειδάση (έμμεση ανίχνευση, εικ. 15.12).
- Προσθήκη κατάλληλου υποστρώματος → παράγεται έγχρωμο προϊόν που κατακρημνίζεται στις θέσεις όπου υπάρχει το σύμπλοκο (χρώση DAB) και εμφανίζεται ως ζώνη.
- Όταν απαιτείται μεγαλύτερη ευαισθησία χρησιμοποιείται η χρώση ECL, 100 φορές πιο ευαίσθητη από τη DAB, που βασίζεται στην αρχή της χημειοφωταύγειας (ανίχνευση της εκπεμπόμενης ακτινοβολίας σε φιλμ).
Σύνοψη: (ενδεικτική) 1. Ηλεκτροφόρηση του δείγματος· 2. μεταφορά των πρωτεϊνών σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης/νάυλον/PVDF (αποτύπωμα)· 3. επώαση με το ειδικό αντίσωμα· 4. δεύτερο αντίσωμα συνδεδεμένο με υπεροξειδάση· 5. υπόστρωμα → έγχρωμο προϊόν που κατακρημνίζεται στις θέσεις του συμπλόκου (DAB)· 6. για ευαισθησία χρώση ECL (χημειοφωταύγεια, 100×).
Κριτήρια αξιολόγησης:
Ερώτηση 15 — Χημειοφωταύγεια
Ερώτηση: Τι είναι η χημειοφωταύγεια;
Απάντηση:
- Χημειοφωταύγεια ονομάζεται το φαινόμενο παραγωγής ακτινοβολίας (φωτός) από μια χημική αντίδραση — η ενέργεια της αντίδρασης απελευθερώνεται ως φωτεινή ακτινοβολία, χωρίς προηγούμενη διέγερση από εξωτερικό φως (σε αντίθεση με τον φθορισμό). Στο ανοσοαποτύπωμα, όταν απαιτείται μεγαλύτερη ευαισθησία, χρησιμοποιείται η χρώση κατά ECL (ενισχυμένη χημειοφωταύγεια), που βασίζεται στην αρχή της φωταύγειας: το ένζυμο (υπεροξειδάση) του δεύτερου αντισώματος καταλύει αντίδραση του υποστρώματος που εκπέμπει φως στις θέσεις του συμπλόκου, το οποίο καταγράφεται (φιλμ/ανιχνευτής). Η ECL είναι 100 φορές πιο ευαίσθητη σε σύγκριση με τη χρωματική χρώση κατά DAB (σελ. 189).
Σύνοψη: (ενδεικτική) Χημειοφωταύγεια = παραγωγή ακτινοβολίας (φωτός) από μια χημική αντίδραση· βάση της χρώσης ECL στο Western Blot, 100× πιο ευαίσθητης από τη DAB.
Κριτήρια αξιολόγησης:
Ερώτηση 16 — Εφαρμογές Western Blot
Ερώτηση: Ποιες οι εφαρμογές του ανοσοαποτυπώματος;
Απάντηση:
- Η μέθοδος του ανοσοαποτυπώματος έχει ευρύτατο φάσμα εφαρμογών — ερευνητικά, για την πιστοποίηση της ύπαρξης και του μοριακού βάρους οποιασδήποτε πρωτεΐνης για την οποία διατίθενται αντισώματα. Κλινική εφαρμογή έχει κυρίως στη διάγνωση των ερπητικών λοιμώξεων, με την ανίχνευση αντισωμάτων στον ορό ασθενών έναντι του ιού του έρπητα τύπου I και II, και του Συνδρόμου Επίκτητης Ανοσολογικής Ανεπάρκειας (AIDS) — όπου χρησιμοποιείται ως επιβεβαιωτική δοκιμασία των αντισωμάτων κατά των πρωτεϊνών του ιού HIV μετά από θετική ELISA (σελ. 189).
Σύνοψη: (ενδεικτική) Ευρύ φάσμα· κλινικά κυρίως διάγνωση ερπητικών λοιμώξεων (αντισώματα κατά έρπητα τύπου I και II) και του AIDS (επιβεβαίωση αντισωμάτων κατά HIV)· ερευνητικά πιστοποίηση οποιασδήποτε πρωτεΐνης.
Κριτήρια αξιολόγησης:
