Λύσεις — Κεφάλαιο 17 (Ερωτήσεις σελ. 211) – ΑΝΟΣΟΛΟΓΙΑ Γ΄ ΕΠΑΛ
Λύσεις — Κεφάλαιο 17 (Ερωτήσεις σελ. 211)
Απαντήσεις στις 7 ερωτήσεις του κεφαλαίου 17.
Ερώτηση 1 — HLA σύστημα
Ερώτηση: Τι είναι το HLA σύστημα ή Μείζον Σύστημα Ιστοσυμβατότητας;
Απάντηση:
- Το HLA σύστημα ή Μείζον Σύστημα Ιστοσυμβατότητας (MHC) είναι ένα σύνολο στενά συνδεδεμένων γονιδίων (στο βραχύ σκέλος του χρωματοσώματος 6) που εκφράζουν τα αντίστοιχα HLA αντιγόνα στην επιφάνεια όλων των εμπύρηνων κυττάρων του οργανισμού — δηλαδή πρωτεΐνες που βρίσκονται στην επιφάνεια των κυττάρων, χαρακτηριστικές για κάθε άνθρωπο, και διακρίνονται σε τρεις κατηγορίες (τάξης I, II, III). Τα γονίδια του MHC είναι πολυμορφικά — υπάρχει μεγάλος αριθμός αλληλομόρφων σε κάθε γονίδιο (αλληλόμορφα = γονίδια στην ίδια γονιδιακή θέση των ομόλογων χρωμοσωμάτων που ελέγχουν την ίδια ιδιότητα με διαφορετικό τρόπο· π.χ. HLA-B: 250 αλληλόμορφα). Παίζουν σημαντικό ρόλο στη μεταμόσχευση (απόρριψη, εκτός αν δότης-δέκτης έχουν ίδια αντιγόνα ιστοσυμβατότητας) και στην ειδική ανοσία (η ενεργοποίηση των λεμφοκυττάρων απαιτεί αντιγονοπαρουσίαση συμπλεγμάτων MHC-πεπτιδίου στον TCR υποδοχέα) (σελ. 203, 210· βλ. κεφ. 7).
Σύνοψη: (ενδεικτική) Σύνολο στενά συνδεδεμένων, πολυμορφικών γονιδίων (χρωμόσωμα 6) που εκφράζουν τα HLA αντιγόνα — πρωτεΐνες της επιφάνειας των εμπύρηνων κυττάρων, χαρακτηριστικές κάθε ανθρώπου (τάξεις I, II, III), με ρόλο στη μεταμόσχευση (απόρριψη) και στην ειδική ανοσία (παρουσίαση MHC-πεπτιδίου στον TCR).
Κριτήρια αξιολόγησης:
Ερώτηση 2 — Κατηγορίες HLA
Ερώτηση: Σε ποιες κατηγορίες διακρίνονται τα HLA αντιγόνα;
Απάντηση:
-
Τα HLA αντιγόνα (πρωτεΐνες της επιφάνειας των κυττάρων) διακρίνονται σε τρεις κατηγορίες: τάξης I, τάξης II και τάξης III (σελ. 203):
- Τάξης I: βρίσκονται σε όλα τα εμπύρηνα κύτταρα του οργανισμού και διακρίνονται στα HLA-A, HLA-B και HLA-C.
- Τάξης II: βρίσκονται κυρίως στα μακροφάγα και τα Β λεμφοκύτταρα (ανοσοδραστικά κύτταρα) και διακρίνονται στα HLA-DP, HLA-DQ και HLA-DR.
- Τάξης III: η γονιδιακή περιοχή ανάμεσα στις δύο προηγούμενες, που δεν κωδικοποιεί αντιγόνα ιστοσυμβατότητας αλλά άλλες πρωτεΐνες σχετικές με το ανοσολογικό σύστημα (συστατικά του συμπληρώματος C2, C4, παράγοντας Β — κεφ. 7).
Κάθε γονίδιο έχει πολλά αλληλόμορφα (π.χ. HLA-B: 250), γι' αυτό η ταυτοποίηση απαιτεί ειδικές τεχνικές.
Σύνοψη: (ενδεικτική) Τρεις κατηγορίες: τάξη I (HLA-A, B, C — σε όλα τα εμπύρηνα κύτταρα), τάξη II (HLA-DP, DQ, DR — μακροφάγα, Β λεμφοκύτταρα), τάξη III (άλλες πρωτεΐνες, π.χ. συμπληρώματος).
Κριτήρια αξιολόγησης:
Ερώτηση 3 — Σημασία HLA ταυτοποίησης
Ερώτηση: Γιατί είναι σημαντική η HLA ταυτοποίηση;
Απάντηση:
- Η ταυτοποίηση (τυποποίηση) των HLA αντιγόνων αποτελεί καθημερινή πρακτική στα σύγχρονα ανοσολογικά εργαστήρια και ιδιαίτερα στα εργαστήρια ιστοσυμβατότητας, γιατί (σελ. 203, 210):
- Στις μεταμοσχεύσεις συμβαίνει πάντα απόρριψη του μοσχεύματος, εκτός αν δότης και δέκτης έχουν τα ίδια αντιγόνα ιστοσυμβατότητας· η HLA τυποποίηση συμβάλλει στη βελτίωση της έκβασης των μεταμοσχεύσεων ιστών και οργάνων, βοηθώντας στην επιλογή του κατάλληλου δότη (και ελέγχεται με τη μικτή λεμφοκυτταρική καλλιέργεια).
- Επιτρέπει τη συσχέτιση των HLA μορίων με νοσήματα (π.χ. HLA-B27 — αγκυλοποιητική σπονδυλίτιδα), με σημασία στη διάγνωση, πρόγνωση και θεραπεία.
- Χρησιμοποιείται στη φυλογενετική ανάλυση των ανθρώπινων φυλών (ανθρωπολογικές μελέτες), καθώς και στον αποκλεισμό πατρότητας (κεφ. 7).
- Σημαντικός είναι και ο ρόλος των HLA στην ειδική ανοσία (αντιγονοπαρουσίαση MHC-πεπτιδίου στον TCR).
Σύνοψη: (ενδεικτική) Γιατί οι μεταμοσχεύσεις απορρίπτονται χωρίς HLA συμβατότητα — η τυποποίηση βελτιώνει την έκβαση με επιλογή κατάλληλου δότη· επιπλέον συσχέτιση HLA-νοσημάτων (διάγνωση-πρόγνωση-θεραπεία) και φυλογενετική/ανθρωπολογική ανάλυση (και πατρότητα).
Κριτήρια αξιολόγησης:
Ερώτηση 4 — Κατηγορίες τεχνικών
Ερώτηση: Σε ποιες κατηγορίες διακρίνονται οι τεχνικές που χρησιμοποιούνται για την HLA ταυτοποίηση;
Απάντηση:
- Οι τεχνικές ιστοσυμβατότητας για την τυποποίηση των HLA αντιγόνων διακρίνονται σε δύο κατηγορίες (σελ. 203, 207, 210):
- Κλασικές ορολογικές μέθοδοι: η μικρολεμφοκυτταρική μέθοδος των δύο σταδίων (κυτταροτοξικότητα με αντιορούς, συμπλήρωμα κουνελιού και χρώση σε πλάκες Terasaki) και η Μικτή Λεμφοκυτταρική Καλλιέργεια (MLR) για την επιλογή δότη.
- Σύγχρονες τεχνικές Μοριακής Βιολογίας (HLA γονιδιακή τυποποίηση), καθιερωμένες σε επίπεδο ρουτίνας: η ανάλυση DNA RFLP (πολυμορφισμοί μήκους θραυσμάτων από περιοριστικά ένζυμα), η PCR-SSO (αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης με ολιγονουκλεοτίδια ειδικής αλληλουχίας) και η PCR-SSP (PCR με εκκινητές ειδικής αλληλουχίας).
Σύνοψη: (ενδεικτική) Δύο κατηγορίες: κλασικές ορολογικές (μικρολεμφοκυτταρική μέθοδος, μικτή λεμφοκυτταρική καλλιέργεια) και σύγχρονες μοριακής βιολογίας (DNA RFLP, PCR-SSO, PCR-SSP).
Κριτήρια αξιολόγησης:
Ερώτηση 5 — Μικρολεμφοκυτταρική μέθοδος
Ερώτηση: Περιγράψτε την Μικρολεμφοκυτταρική Μέθοδο.
Απάντηση:
- Η μικρολεμφοκυτταρική μέθοδος είναι ορολογική τεχνική δύο σταδίων με χρήση συμπληρώματος κουνελιού και χρώσης (κυανό του μεθυλενίου / Trypan Blue) — μέθοδος κυτταροτοξικότητας (εικ. 17.1, σελ. 203-205):
- Αρχή: τα λεμφοκύτταρα που φέρουν στην επιφάνειά τους το HLA αντιγόνο έναντι του οποίου περιέχει αντισώματα ο ορός (αντιορός γνωστής ειδικότητας) σχηματίζουν σύμπλεγμα αντιγόνου-αντισώματος· στη συνέχεια ενεργοποιείται το συμπλήρωμα, το οποίο καταστρέφει την κυτταρική μεμβράνη του λεμφοκυττάρου.
- Ανάγνωση: με την προσθήκη της χρωστικής Trypan Blue διαπιστώνεται η ύπαρξη ζώντων ή νεκρών λεμφοκυττάρων — τα ζωντανά δεν επιτρέπουν την είσοδο της χρωστικής, ενώ τα νεκρά βάφονται. Με απλή παρατήρηση στο μικροσκόπιο διαπιστώνεται η ύπαρξη ή όχι των συγκεκριμένων HLA αντιγόνων: νεκρά (μπλε) κύτταρα σε ένα φρεάτιο = τα λεμφοκύτταρα φέρουν το HLA του αντίστοιχου αντιορού.
- Εκτέλεση: η όλη διαδικασία γίνεται σε πλάκες Terasaki, που φέρουν φρεάτια πολύ μικρού όγκου· σε αυτά προσθέτουμε τους αντίστοιχους αντιορούς (πάνελ γνωστών ειδικοτήτων HLA-A, B, C, DR…) και στη συνέχεια τα απομονωμένα λεμφοκύτταρα του εξεταζομένου (1ο στάδιο: επώαση αντιορού-κυττάρων· 2ο στάδιο: προσθήκη συμπληρώματος κουνελιού και χρωστικής).
Σύνοψη: (ενδεικτική) Ορολογική μέθοδος 2 σταδίων σε πλάκες Terasaki (μικρά φρεάτια με αντιορούς γνωστής ειδικότητας + απομονωμένα λεμφοκύτταρα): αν το λεμφοκύτταρο φέρει το HLA → σύμπλεγμα → ενεργοποίηση συμπληρώματος κουνελιού → λύση μεμβράνης → βάφεται με Trypan Blue (νεκρό), τα ζωντανά όχι → ανάγνωση στο μικροσκόπιο.
Κριτήρια αξιολόγησης:
Ερώτηση 6 — Στάδια MLR
Ερώτηση: Ποια τα στάδια της Μικτής Λεμφοκυτταρικής Καλλιέργειας (MLR);
Απάντηση:
-
Η Μικτή Λεμφοκυτταρική Καλλιέργεια (ΜΛΚ, MLR) είναι τεχνική ιστοσυμβατότητας για την επιλογή του κατάλληλου δότη στις μεταμοσχεύσεις (εικ. 17.2, σελ. 205):
- Σε καλλιεργητικό μέσο αναμειγνύονται τα λεμφοκύτταρα του δότη και του δέκτη του μοσχεύματος.
- Αναστολή της ικανότητας πολλαπλασιασμού των λεμφοκυττάρων του δότη (διεγείροντα κύτταρα), είτε με τη χημική ουσία Μιτομυκίνη C είτε με ακτινοβόλησή τους — ώστε να πολλαπλασιάζονται μόνο τα (αποκρινόμενα) λεμφοκύτταρα του δέκτη.
- Συγκαλλιέργεια των δύο πληθυσμών σε φρεάτια πλακών κυτταρικής καλλιέργειας για πέντε ημέρες.
- Προσθήκη τριτιωμένης θυμιδίνης (³H), η οποία προσλαμβάνεται από το νεοσυντιθέμενο DNA των λεμφοκυττάρων που πολλαπλασιάζονται.
- Μετά από σύντομο διάστημα τα κύτταρα αναρροφώνται σε ειδικά απορροφητικά φίλτρα μαζί με τη ραδιενέργεια που προσέλαβαν.
- Μέτρηση σε μετρητή β-ακτινοβολίας.
Ερμηνεία: όσο μεγαλύτερη η διέγερση και ο πολλαπλασιασμός των λεμφοκυττάρων (του δέκτη από τα HLA του δότη), τόσο μεγαλύτερες οι τιμές ραδιενέργειας → μεγαλύτερη ασυμβατότητα· χαμηλή ραδιενέργεια = καλή συμβατότητα.
Σύνοψη: (ενδεικτική) 1. Ανάμειξη λεμφοκυττάρων δότη-δέκτη· 2. αναστολή πολλαπλασιασμού των κυττάρων του δότη (Μιτομυκίνη C ή ακτινοβόληση)· 3. συγκαλλιέργεια σε φρεάτια 5 ημέρες· 4. προσθήκη ³H-θυμιδίνης (ενσωμάτωση στο νέο DNA)· 5. αναρρόφηση σε φίλτρα· 6. μέτρηση σε μετρητή β — μεγάλη ραδιενέργεια = μεγάλη διέγερση = ασυμβατότητα.
Κριτήρια αξιολόγησης:
Ερώτηση 7 — Μοριακές τεχνικές
Ερώτηση: Αναφέρατε τις μοριακές τεχνικές HLA ταυτοποίησης.
Απάντηση:
- Με την πρόοδο της Μοριακής Βιολογίας καθιερώθηκε σε επίπεδο ρουτίνας η HLA γονιδιακή τυποποίηση, με τρεις τεχνικές (σελ. 207-209):
- DNA RFLP ανάλυση (ανάλυση των πολυμορφισμών μήκους θραύσματος από περιοριστικό ένζυμο): στηρίζεται στο σπάσιμο του DNA από ένζυμα περιορισμού που κόβουν σε συγκεκριμένες θέσεις· τα κομμάτια ανιχνεύονται με ειδικούς ανιχνευτές για τη μοριακή τυποποίηση των αλληλομόρφων. Επίπονη και χρονοβόρα μέθοδος (εικ. 17.3).
- PCR-SSO (PCR με ολιγονουκλεοτίδια ειδικής αλληλουχίας): ενίσχυση του DNA στόχου με PCR και στη συνέχεια υβριδισμός του προϊόντος με ολιγονουκλεοτίδια ειδικής αλληλουχίας, ξεχωριστά για κάθε HLA-A, B, C, DR, DP, DQ ειδικότητα. Από τις πιο καθιερωμένες, επιτρέπει την τυποποίηση μεγάλου αριθμού δειγμάτων με αξιοπιστία και ακρίβεια.
- PCR-SSP (PCR με εκκινητές ειδικής αλληλουχίας): ολοκληρώνεται με την PCR σε ένα στάδιο, αφού οι ειδικοί εκκινητές επιτρέπουν άμεση τυποποίηση· πολύ σύντομη (μόλις 3 ώρες) και υψηλής ακρίβειας, καθιερωμένη στην κλινική πράξη, αλλά όχι κατάλληλη για μεγάλο αριθμό δειγμάτων και απαιτεί μεγάλη ποσότητα αρχικού DNA.
Σύνοψη: (ενδεικτική) 1. DNA RFLP (ένζυμα περιορισμού → θραύσματα → ανιχνευτές· επίπονη, χρονοβόρα)· 2. PCR-SSO (PCR + υβριδισμός με ολιγονουκλεοτίδια ειδικής αλληλουχίας ανά HLA-A/B/C/DR/DP/DQ· πολλά δείγματα, αξιόπιστη)· 3. PCR-SSP (PCR ενός σταδίου με ειδικούς εκκινητές· ≈ 3 ώρες, ακριβής, όχι για πολλά δείγματα, πολύ DNA).
Κριτήρια αξιολόγησης:
