Λύσεις — Κεφάλαιο 16 (Ερωτήσεις σελ. 201) – ΑΝΟΣΟΛΟΓΙΑ Γ΄ ΕΠΑΛ
Λύσεις — Κεφάλαιο 16 (Ερωτήσεις σελ. 201)
Απαντήσεις στις 6 ερωτήσεις του κεφαλαίου 16.
Ερώτηση 1 — Σημασία αριθμού λεμφοκυττάρων
Ερώτηση: Γιατί είναι σημαντικό να γνωρίζουμε τον αριθμό των λεμφοκυττάρων στο περιφερικό αίμα;
Απάντηση:
- Τα λεμφοκύτταρα (Τ και Β) είναι υπεύθυνα για τους μηχανισμούς της ειδικής ανοσολογικής αντίδρασης: όταν ο οργανισμός προσβληθεί από παθογόνο, τα Β πολλαπλασιάζονται γρήγορα για να εκκρίνουν αντισώματα (χυμική ανοσία), ενώ τα Τ βοηθητικά εκκρίνουν λεμφοκίνες που κινητοποιούν τα Τ κυτταροτοξικά (κυτταρική ανοσία). Επομένως ο αριθμός των κυκλοφορούντων λεμφοκυττάρων στο περιφερικό αίμα αποτελεί κριτήριο στις σύγχρονες διαγνωστικές μεθόδους για την ύπαρξη ή όχι κάποιου εισβολέα, άρα ένδειξη λοίμωξης από βακτήριο, ιό ή μύκητα (φυσιολογικά 2500/μl, εύρος 1000-4800). Επίσης, στο πλαίσιο της μελέτης των ανοσολογικών αποκρίσεων για την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών πρωτοκόλλων σε ασθένειες με σοβαρές επιπτώσεις — όπως το AIDS (όπου καταστρέφονται τα CD4 Τ βοηθητικά) και οι διάφορες μορφές νεοπλασμάτων — είναι απαραίτητη η μελέτη των λεμφοκυττάρων: απομόνωσή τους, προσδιορισμός του αριθμού τους και διαχωρισμός σε υποπληθυσμούς (σελ. 193, 200).
Σύνοψη: (ενδεικτική) Ο αριθμός των λεμφοκυττάρων (φυσιολογικά ≈ 2500/μl) είναι κριτήριο ύπαρξης εισβολέα — ένδειξη λοίμωξης από βακτήριο, ιό, μύκητα· απαραίτητος και στη μελέτη ανοσολογικών αποκρίσεων για θεραπευτικά πρωτόκολλα (AIDS, νεοπλάσματα), με απομόνωση, μέτρηση και διαχωρισμό υποπληθυσμών.
Κριτήρια αξιολόγησης:
Ερώτηση 2 — Στάδια απομόνωσης
Ερώτηση: Ποια είναι τα στάδια απομόνωσης των λεμφοκυττάρων;
Απάντηση:
- Πηγή τα λεμφοκύτταρα του περιφερικού αίματος, που μετά την αιμοληψία τοποθετείται σε φιαλίδια με αντιπηκτικό (ηπαρίνη). Η απομόνωση γίνεται με το συνθετικό μέσο Ficoll-Hypaque — διάλυμα πυκνότερο από τα λεμφοκύτταρα αλλά αραιότερο από τα ερυθροκύτταρα και τα κοκκιοκύτταρα (εικ. 16.1, σελ. 193-194):
- Το αίμα αραιώνεται 1:1 με κατάλληλο ρυθμιστικό διάλυμα.
- Επιστιβάζεται με προσοχή πάνω σε διάλυμα Ficoll-Hypaque, ώστε να σχηματιστεί χαρακτηριστικό δίστιβο.
- Φυγοκεντρείται → σχηματίζονται διαβαθμισμένες, διακριτές στιβάδες: στον πυθμένα τα ερυθροκύτταρα και τα κοκκιοκύτταρα (πυκνότερα του Ficoll), πάνω από το Ficoll-Hypaque η στιβάδα των λεμφοκυττάρων (και ελάχιστων μονοκυττάρων), και από πάνω το πλάσμα.
- Με σύριγγα παίρνουμε τα κύτταρα της στιβάδας των λεμφοκυττάρων.
- Ακολουθούν δύο διαδοχικές φυγοκεντρήσεις για την απομάκρυνση του Ficoll-Hypaque, που σε παρατεταμένη επαφή είναι τοξικό για τα κύτταρα.
- Το εναιώρημα αφήνεται 1 ώρα σε ηρεμία σε επωαστικό θάλαμο: τα μονοκύτταρα προσκολλώνται στην επιφάνεια του φιαλιδίου, ενώ τα λεμφοκύτταρα απομακρύνονται σε καθαρή πλέον μορφή.
Σύνοψη: (ενδεικτική) Αίμα με ηπαρίνη → αραίωση 1:1 → επιστίβαση σε Ficoll-Hypaque → φυγοκέντρηση (πυθμένας ερυθρά-κοκκιοκύτταρα, πάνω από το Ficoll λεμφοκύτταρα, πάνω πλάσμα) → λήψη στιβάδας με σύριγγα → 2 φυγοκεντρήσεις (απομάκρυνση τοξικού Ficoll) → 1 ώρα ηρεμία (μονοκύτταρα προσκολλώνται) → καθαρά λεμφοκύτταρα.
Κριτήρια αξιολόγησης:
Ερώτηση 3 — Μέτρηση λεμφοκυττάρων
Ερώτηση: Με ποιο τρόπο γίνεται η μέτρηση των λεμφοκυττάρων;
Απάντηση:
- Η μέτρηση του αριθμού των λεμφοκυττάρων γίνεται με τη χρήση ειδικής πλάκας καταμέτρησης κυττάρων, της πλάκας Neubauer (εικ. 16.2, σελ. 196). Πρόκειται για αντικειμενοφόρο πλάκα που φέρει ειδικές διαγραμμίσεις, οι οποίες σχηματίζουν τετραγωνίδια σταθερού (γνωστού) όγκου. Με τις κατάλληλες αραιώσεις του εναιωρήματος των απομονωμένων λεμφοκυττάρων, μετρούμε τον αριθμό των κυττάρων στα αντίστοιχα τετραγωνίδια σε ένα απλό φωτονικό μικροσκόπιο και, γνωρίζοντας τον όγκο και την αραίωση, υπολογίζουμε τη συγκέντρωση (κύτταρα ανά μl). Παράλληλα, με τη χρωστική Trypan Blue διακρίνονται τα ζωντανά από τα νεκρά κύτταρα (βιωσιμότητα). Φυσιολογικά τα λεμφοκύτταρα είναι κατά μέσο όρο 2500/μl (1000-4800) — Τ βοηθητικά 55%, Τ κυτταροτοξικά 25%, Β 10%, ΝΚ κ.ά. 10% (πίν. 16.1).
Σύνοψη: (ενδεικτική) Με την πλάκα Neubauer — αντικειμενοφόρο με διαγραμμίσεις-τετραγωνίδια σταθερού όγκου: μετά από κατάλληλες αραιώσεις μετρούνται τα κύτταρα στα τετραγωνίδια σε απλό φωτονικό μικροσκόπιο και υπολογίζεται ο αριθμός/μl (φυσιολογικά ≈ 2500).
Κριτήρια αξιολόγησης:
Ερώτηση 4 — Βιωσιμότητα
Ερώτηση: Με ποιο τρόπο γίνεται ο υπολογισμός της βιωσιμότητας των λεμφοκυττάρων;
Απάντηση:
- Ο υπολογισμός της βιωσιμότητας γίνεται κατά την καταμέτρηση στην πλάκα Neubauer με τη χρήση της κατάλληλης χρωστικής, της Trypan Blue: η χρωστική αυτή εισέρχεται στο εσωτερικό των νεκρών κυττάρων (των οποίων η μεμβράνη έχει χάσει την ακεραιότητά της) και τα βάφει με το χαρακτηριστικό μπλε χρώμα της, ενώ τα ζωντανά κύτταρα δεν επιτρέπουν την είσοδό της και παραμένουν άχρωμα-διαθλαστικά. Έτσι, μετρώντας στο μικροσκόπιο τα άχρωμα (ζωντανά) και τα μπλε (νεκρά) κύτταρα, υπολογίζουμε, εκτός από τον αριθμό, και το ποσοστό βιωσιμότητας (ζωντανά / σύνολο × 100) των λεμφοκυττάρων (σελ. 196). Η ίδια αρχή χρησιμοποιείται και στη μικρολεμφοκυτταρική μέθοδο της HLA ταυτοποίησης (κεφ. 17).
Σύνοψη: (ενδεικτική) Με τη χρωστική Trypan Blue στην πλάκα Neubauer: εισέρχεται μόνο στα νεκρά κύτταρα και τα βάφει μπλε, τα ζωντανά μένουν άχρωμα → ποσοστό ζωντανών/σύνολο = βιωσιμότητα.
Κριτήρια αξιολόγησης:
Ερώτηση 5 — Επιφανειακοί δείκτες
Ερώτηση: Τι ονομάζουμε επιφανειακούς δείκτες των λεμφοκυττάρων;
Απάντηση:
- Τα λεμφοκύτταρα αποτελούνται από πολλούς λειτουργικά διακριτούς υποπληθυσμούς, αν και στο μικροσκόπιο όλα έχουν την ίδια μορφή (μικρά στρογγυλά κύτταρα με λίγο κυτταρόπλασμα). Η διάκριση κάθε πληθυσμού επιτυγχάνεται με την εκμετάλλευση πρωτεϊνών της κυτταρικής τους επιφάνειας που είναι χαρακτηριστικές για κάθε πληθυσμό — τους επιφανειακούς δείκτες. Έχει χαρακτηριστεί μεγάλος αριθμός δεικτών, που κατατάσσονται με συστηματική ονοματολογία, το σύστημα CD (Cluster Designation), με αύξοντα αριθμό (CD2, CD16, CD83, CD164 κ.λπ.). Τα Τ λεμφοκύτταρα στο σύνολό τους χαρακτηρίζονται από τον δείκτη CD3 (μόριο υπεύθυνο για την ενεργοποίησή τους)· σημαντικότερος δείκτης των Β λεμφοκυττάρων είναι ο CD19· τα Τ διακρίνονται περαιτέρω σε Τ βοηθητικά — CD4 και Τ κυτταροτοξικά — CD8. Οι δείκτες ανιχνεύονται με μονοκλωνικά αντισώματα (κυτταρομετρία ροής) (σελ. 197).
Σύνοψη: (ενδεικτική) Επιφανειακοί δείκτες = πρωτεΐνες της κυτταρικής επιφάνειας χαρακτηριστικές για κάθε υποπληθυσμό λεμφοκυττάρων, με ονοματολογία CD: Τ → CD3, Β → CD19, Τ βοηθητικά → CD4, Τ κυτταροτοξικά → CD8· ανιχνεύονται με μονοκλωνικά αντισώματα.
Κριτήρια αξιολόγησης:
Ερώτηση 6 — Κυτταρόμετρο ροής
Ερώτηση: Τι είναι το κυτταρόμετρο ροής και ποια τα πλεονεκτήματά του;
Απάντηση:
-
Το κυτταρόμετρο ροής είναι όργανο αυτοματοποιημένης μεθόδου μέτρησης και διαχωρισμού κυττάρων με βάση συγκεκριμένα φυσικοχημικά τους χαρακτηριστικά — το μέγεθος και την πολυπλοκότητά τους — σε συνδυασμό με την ένταση του φθορισμού μονοκλωνικών αντισωμάτων (συζευγμένων με φθορίζουσες χρωστικές, π.χ. FITC, PE) έναντι επιφανειακών δεικτών. Έχει την ικανότητα να εξετάζει ξεχωριστά κάθε ένα κύτταρο ενός κυτταρικού εναιωρήματος με την πρόσπτωση δέσμης Laser πάνω του, και να προσδιορίζει την ένταση δύο τουλάχιστον διαφορετικών φθοριοχρωμάτων (εικ. 16.3). Για τον προσδιορισμό Τ και Β λεμφοκυττάρων: τα απομονωμένα λεμφοκύτταρα επωάζονται με μονοκλωνικά αντι-CD3 και αντι-CD19 συζευγμένα με FITC/PE, δεσμεύονται στα κύτταρα με τους δείκτες, περνούν από τον κυτταρομετρητή και τα αποτελέσματα εμφανίζονται ως γραφικές παραστάσεις και ποσοστά.
Πλεονεκτήματα: η πλήρης αυτοματοποίηση, που επιτρέπει τον έλεγχο τεράστιου αριθμού κυττάρων και την ανίχνευση έστω και μικρού αριθμού κυττάρων που ανήκουν σε συγκεκριμένο πληθυσμό· χρησιμοποιείται στην καθημερινή διαγνωστική πρακτική σε ανοσολογικά, αιματολογικά και νεοπλασματικά νοσήματα (σελ. 199-200).
Σύνοψη: (ενδεικτική) Αυτοματοποιημένο όργανο που εξετάζει κάθε κύτταρο ξεχωριστά με δέσμη Laser, μετρώντας μέγεθος, πολυπλοκότητα και φθορισμό ≥ 2 φθοριοχρωμάτων μονοκλωνικών (αντι-CD3/CD19 με FITC/PE) → ποσοστά υποπληθυσμών· πλεονεκτήματα: πλήρης αυτοματοποίηση, τεράστιος αριθμός κυττάρων, ανίχνευση μικρών πληθυσμών· ανοσολογικά-αιματολογικά-νεοπλασματικά νοσήματα.
Κριτήρια αξιολόγησης:
