Γιατί οι περιοριστικές ενδονουκλεάσες και οι φορείς κλωνοποίησης είναι απαραίτητα εργαλεία για τη Γενετική Μηχανική;
Σκέψη / Μεθοδολογία: Χρειαζόμαστε ένα εργαλείο για να κόψουμε επιλεκτικά DNA σε συγκεκριμένα σημεία (περιοριστικές ενδονουκλεάσες) και ένα «όχημα» που θα μεταφέρει και θα πολλαπλασιάσει το κομμένο τμήμα μέσα σε κύτταρο-ξενιστή (φορέας κλωνοποίησης).
Απάντηση: Οι περιοριστικές ενδονουκλεάσες επιτρέπουν να κόψουμε το DNA με ακρίβεια σε συγκεκριμένες αλληλουχίες, παράγοντας τμήματα με προβλέψιμα (συχνά συμπληρωματικά/κολλώδη) άκρα. Οι φορείς κλωνοποίησης (πλασμίδια, DNA φάγων) είναι μόρια DNA ικανά να αυτοδιπλασιάζονται μέσα σε κύτταρο-ξενιστή και «μεταφέρουν» το κομμένο τμήμα DNA μέσα σε αυτό, ώστε να πολλαπλασιαστεί μαζί με το βακτήριο. Χωρίς τα δύο αυτά εργαλεία δεν θα ήταν δυνατή ούτε η επιλεκτική κοπή ούτε η πολλαπλασίαση/κλωνοποίηση συγκεκριμένων τμημάτων DNA.
Τι είναι μια γονιδιωματική βιβλιοθήκη; α. ένας κλώνος βακτηρίων που περιέχει ένα τμήμα DNA ενός οργανισμού β. μια συλλογή βιβλίων για κλώνους γ. ένα σύνολο από κλώνους βακτηρίων που ο καθένας έχει ένα πλασμίδιο με διαφορετικό τμήμα DNA ενός οργανισμού δ. ένα σύνολο από περιοριστικές ενδονουκλεάσες που χρησιμοποιούνται για να παράγουν διαφορετικούς κλώνους ε. τίποτε από τα παραπάνω. Ποια είναι η σωστή απάντηση;
Σκέψη / Μεθοδολογία: Ορισμός: το σύνολο (όχι ένας μόνο κλώνος) των κλώνων που, μαζί, καλύπτουν ολόκληρο το γονιδίωμα.
Απάντηση: Σωστή είναι η (γ): ένα σύνολο από κλώνους βακτηρίων, όπου κάθε κλώνος φέρει ένα πλασμίδιο (ή φάγο) με διαφορετικό τμήμα DNA του οργανισμού· το σύνολο των κλώνων καλύπτει ολόκληρο το γονιδίωμά του.
Πρόσεξε:
Θα μπορούσε να αναπτυχθεί η τεχνολογία του ανασυνδυασμένου DNA αν ο γενετικός κώδικας δεν ήταν καθολικός; Αιτιολογήστε την απάντησή σας.
Σκέψη / Μεθοδολογία: Η βασική εφαρμογή της τεχνολογίας (π.χ. παραγωγή ανθρώπινης πρωτεΐνης μέσα σε βακτήριο) προϋποθέτει ότι το βακτηριακό κύτταρο «διαβάζει» τα κωδικόνια του εισαχθέντος γονιδίου με τον ίδιο ακριβώς τρόπο που τα διαβάζει το ανθρώπινο κύτταρο.
Απάντηση: Όχι, ή τουλάχιστον όχι με τη σημερινή της μορφή. Η τεχνολογία του ανασυνδυασμένου DNA βασίζεται στο ότι ο γενετικός κώδικας είναι καθολικός (ίδιος σχεδόν σε όλους τους οργανισμούς): ένα ανθρώπινο γονίδιο που εισάγεται σε βακτήριο μεταφράζεται σωστά μόνο επειδή το βακτήριο χρησιμοποιεί τα ίδια κωδικόνια με την ίδια σημασία. Αν ο κώδικας δεν ήταν καθολικός, η μεταφορά ενός γονιδίου από έναν οργανισμό σε άλλον θα παρήγαγε λανθασμένη (ή καθόλου) πρωτεΐνη, αφού ο ξενιστής θα «διάβαζε» διαφορετικά τα ίδια κωδικόνια — οπότε δεν θα ήταν δυνατή η παραγωγή χρήσιμων πρωτεϊνών (π.χ. ανθρώπινης ινσουλίνης) μέσα σε βακτήρια.
Πρόσεξε:
Για ποιο λόγο, κατά την ενσωμάτωση DNA ευκαρυωτικού οργανισμού σε πλασμίδιο, χρησιμοποιείται η ίδια περιοριστική ενδονουκλεάση για να κόψει το πλασμίδιο και το DNA του οργανισμού;
Σκέψη / Μεθοδολογία: Η ίδια ενδονουκλεάση αναγνωρίζει την ίδια αλληλουχία-στόχο και κόβει πάντα στο ίδιο σημείο, αφήνοντας τα ίδια μονόκλωνα (κολλώδη) άκρα και στα δύο μόρια DNA.
Απάντηση: Επειδή η ίδια περιοριστική ενδονουκλεάση κόβει πάντα την ίδια αλληλουχία-στόχο, αφήνοντας πανομοιότυπα μονόκλωνα («κολλώδη») άκρα και στα δύο μόρια DNA (πλασμίδιο και «ξένο» DNA). Τα άκρα αυτά είναι συμπληρωματικά μεταξύ τους, άρα μπορούν να σχηματίσουν δεσμούς υδρογόνου και να ενωθούν με τη βοήθεια της DNA δεσμάσης. Αν χρησιμοποιούνταν διαφορετικές ενδονουκλεάσες, τα άκρα των δύο μορίων δεν θα ήταν συμπληρωματικά και δεν θα μπορούσαν να ενωθούν.
Ποιος είναι ο ρόλος των παρακάτω στις τεχνικές Γενετικής Μηχανικής; α. Περιοριστικές ενδονουκλεάσες β. Πλασμίδια γ. Βακτήρια.
Σκέψη / Μεθοδολογία: Τρεις ξεχωριστοί ρόλοι στην ίδια αλυσίδα διαδικασιών: κοπή → μεταφορά/πολλαπλασιασμός φορέα → ξενιστής/«εργοστάσιο» παραγωγής.
Απάντηση: α. Οι περιοριστικές ενδονουκλεάσες κόβουν το DNA σε συγκεκριμένες αλληλουχίες-στόχους, παράγοντας τμήματα με (συνήθως) συμπληρωματικά κολλώδη άκρα. β. Τα πλασμίδια λειτουργούν ως φορείς κλωνοποίησης — μεταφέρουν το «ξένο» DNA μέσα στο κύτταρο-ξενιστή και αυτοδιπλασιάζονται ανεξάρτητα, πολλαπλασιάζοντας μαζί τους και το ενσωματωμένο τμήμα. γ. Τα βακτήρια λειτουργούν ως κύτταρα-ξενιστές: δέχονται το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο (μετασχηματισμός), πολλαπλασιάζονται δίνοντας κλώνους, και μπορούν επίσης να εκφράσουν το εισαχθέν γονίδιο παράγοντας τη σχετική πρωτεΐνη.
Οι περιοριστικές ενδονουκλεάσες: α. παράγονται φυσιολογικά από ευκαρυωτικά κύτταρα β. κόβουν μονόκλωνα μόρια DNA γ. κόβουν το DNA σε πολύ εξειδικευμένες θέσεις δ. εισάγονται στα βακτήρια από τους βακτηριοφάγους. Ποια από τις προτάσεις αυτές είναι σωστή;
Σκέψη / Μεθοδολογία: Θυμόμαστε: παράγονται από βακτήρια (όχι ευκαρυωτικά), κόβουν δίκλωνο (όχι μονόκλωνο) DNA, σε συγκεκριμένες/εξειδικευμένες αλληλουχίες αναγνώρισης.
Απάντηση: Σωστή είναι η (γ): οι περιοριστικές ενδονουκλεάσες κόβουν το DNA σε πολύ εξειδικευμένες θέσεις (συγκεκριμένες αλληλουχίες αναγνώρισης 4-8 νουκλεοτιδίων). Παράγονται φυσιολογικά από βακτήρια (όχι ευκαρυωτικά κύτταρα) και κόβουν δίκλωνο (όχι μονόκλωνο) DNA.
Ποια από τις παρακάτω προτάσεις που αφορούν την DNA δεσμάση είναι λανθασμένη; α. είναι ένζυμο β. είναι φυσιολογικό συστατικό των κυττάρων γ. μπορεί να ενώνει κομμάτια στο ανασυνδυασμένο DNA δ. παίρνει μέρος στην αντιγραφή του DNA ε. ενώνει πολυπεπτίδια
Σκέψη / Μεθοδολογία: Η DNA δεσμάση ενώνει τμήματα νουκλεϊκού οξέος (φωσφοδιεστερικούς δεσμούς), όχι πεπτιδικούς δεσμούς μεταξύ αμινοξέων/πολυπεπτιδίων — αυτό είναι έργο του ριβοσώματος.
Απάντηση: Λανθασμένη είναι η (ε): η DNA δεσμάση ενώνει τμήματα DNA (φωσφοδιεστερικούς δεσμούς μεταξύ νουκλεοτιδίων), όχι πολυπεπτίδια — η σύνδεση αμινοξέων σε πολυπεπτίδιο γίνεται από το ριβόσωμα κατά τη μετάφραση, όχι από τη DNA δεσμάση.
Πρόσεξε: