Κεφάλαιο 9.5 – Χρήσιμες πρωτεΐνες από ανασυνδυασμένα βακτήρια – Απαντήσεις – Λύσεις (σελ. 69)

Ερωτήσεις (σελ. 69)

Άσκηση Ε12 (σελ. 69)

Σε πείραμα Γενετικής Μηχανικής χρησιμοποιείται πλασμίδιο το οποίο έχει δύο γονίδια ανθεκτικότητας σε αντιβιοτικά: το ένα γονίδιο προσδίδει ανθεκτικότητα σε αμπικιλίνη και το άλλο σε στρεπτομυκίνη. Στο πλασμίδιο αυτό εισάγεται τμήμα DNA μέσα στο γονίδιο ανθεκτικότητας της αμπικιλίνης. Στη συνέχεια με το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο μετασχηματίζονται κύτταρα Escherichia coli που δεν είναι ανθεκτικά σε κανένα από τα δύο αντιβιοτικά. Αναλύστε τον τρόπο με τον οποίο μπορούν να επιλεγούν τα βακτήρια που περιέχουν το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο.

Σκέψη / Μεθοδολογία: Ίδια λογική με το πλασμίδιο pBR322 (§9.5): η ενσωμάτωση «ξένου» DNA μέσα σε ένα γονίδιο ανθεκτικότητας το απενεργοποιεί, ενώ το άλλο γονίδιο ανθεκτικότητας παραμένει άθικτο. Συγκρίνουμε την ανάπτυξη σε δύο διαφορετικά θρεπτικά υλικά, το καθένα με ένα από τα δύο αντιβιοτικά.

Λύση:

1. Τα βακτήρια που δεν προσέλαβαν καθόλου πλασμίδιο δεν είναι ανθεκτικά σε κανένα αντιβιοτικό — δεν αναπτύσσονται σε κανένα από τα δύο θρεπτικά υλικά.
2. Τα βακτήρια που προσέλαβαν το αρχικό (μη ανασυνδυασμένο) πλασμίδιο είναι ανθεκτικά ΚΑΙ στην αμπικιλίνη ΚΑΙ στη στρεπτομυκίνη, αφού και τα δύο γονίδια ανθεκτικότητας παραμένουν άθικτα — αναπτύσσονται και στα δύο θρεπτικά υλικά.
3. Τα βακτήρια που προσέλαβαν το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο (με το «ξένο» DNA μέσα στο γονίδιο ανθεκτικότητας στην αμπικιλίνη) έχουν το γονίδιο αυτό κατεστραμμένο, άρα είναι ΕΥΑΙΣΘΗΤΑ στην αμπικιλίνη, αλλά παραμένουν ανθεκτικά στη στρεπτομυκίνη, αφού εκείνο το γονίδιο παρέμεινε ανέπαφο.
4. Καλλιεργούμε λοιπόν τα μετασχηματισμένα βακτήρια πρώτα σε θρεπτικό υλικό με στρεπτομυκίνη (επιβιώνουν όσα έχουν οποιοδήποτε πλασμίδιο) και στη συνέχεια τα επιβιώσαντα σε θρεπτικό υλικό με αμπικιλίνη: όσα ΔΕΝ αναπτύσσονται στην αμπικιλίνη (αλλά αναπτύχθηκαν στη στρεπτομυκίνη) είναι ακριβώς εκείνα που φέρουν το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο με το επιθυμητό «ξένο» DNA.

Απάντηση: Τα βακτήρια που φέρουν το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο ταυτοποιούνται ως εκείνα που είναι ανθεκτικά στη στρεπτομυκίνη αλλά ΕΥΑΙΣΘΗΤΑ στην αμπικιλίνη (αφού το γονίδιο ανθεκτικότητας στην αμπικιλίνη καταστράφηκε από την ενσωμάτωση του «ξένου» DNA) — εντοπίζονται με διαδοχική καλλιέργεια σε τρυβλία με τα δύο αντιβιοτικά ξεχωριστά και σύγκριση των αποτελεσμάτων ανάπτυξης.

Πρόσεξε:

• Το κριτήριο δεν είναι απλώς «ανθεκτικό σε ένα αντιβιοτικό» αλλά η ΣΥΓΚΕΚΡΙΜΕΝΗ συνδυασμένη ιδιότητα: ανθεκτικό στο ένα ΚΑΙ ευαίσθητο στο άλλο.