Κεφάλαιο 9.2 – Κλωνοποίηση του mRNA. Κατασκευή cDNA βιβλιοθήκης – Απαντήσεις – Λύσεις (σελ. 69)

Ερωτήσεις (σελ. 69)

Άσκηση Ε4 (σελ. 69)

Εξηγήστε με σχήματα το πώς παράγεται το cDNA και το πώς χρησιμοποιείται στην τεχνολογία του ανασυνδυασμένου DNA.

Σκέψη / Μεθοδολογία: Περιγράφουμε λεκτικά τα διαδοχικά στάδια (καθώς η απάντηση ζητά σχήμα, δίνουμε την πλήρη λεκτική περιγραφή που θα συνόδευε ένα διάγραμμα με 4 βήματα).

Απάντηση: Στάδιο 1: Απομονώνεται το ώριμο mRNA από κύτταρα που εκφράζουν το συγκεκριμένο γονίδιο. Στάδιο 2: Με το ένζυμο αντίστροφη μεταγραφάση, το mRNA χρησιμεύει ως καλούπι για τη σύνθεση συμπληρωματικού DNA (cDNA) — προκύπτει υβρίδιο cDNA-mRNA. Στάδιο 3: Το mRNA διασπάται (χημικά ή με θέρμανση) και το cDNA χρησιμεύει ως καλούπι για σύνθεση της δεύτερης αλυσίδας DNA, δίνοντας δίκλωνο DNA. Στάδιο 4: Το δίκλωνο cDNA ενσωματώνεται σε πλασμίδιο/φάγο και εισάγεται σε βακτήριο-ξενιστή (μετασχηματισμός), όπου πολλαπλασιάζεται και μπορεί να εκφραστεί παράγοντας την αντίστοιχη πρωτεΐνη. Σε σχηματική αναπαράσταση: mRNA →(αντίστροφη μεταγραφάση)→ cDNA-mRNA υβρίδιο →(διάσπαση mRNA + DNA πολυμεράση)→ δίκλωνο cDNA →(ενσωμάτωση σε φορέα)→ κλωνοποίηση σε βακτήριο.

Πρόσεξε:

• Το mRNA χρησιμεύει ΜΟΝΟ ως αρχικό καλούπι — καταστρέφεται στο 3ο στάδιο, δεν επιβιώνει στο τελικό ανασυνδυασμένο μόριο.

Άσκηση Ε5 (σελ. 69)

Συμπληρώστε με τις κατάλληλες λέξεις τα κενά στο κείμενο: Το DNA κόβεται με .......... σε κομμάτια με γνωστά άκρα. Τα κομμάτια συνδέονται με ένα .........., που έχει συμπληρωματικά άκρα, με τη βοήθεια ενός ενζύμου που λέγεται .......... Το cDNA μπορεί να κατασκευαστεί από το .......... με τη βοήθεια ενζύμου που ονομάζεται .......... και να συνδεθεί με ένα .......... Το ανασυνδυασμένο μόριο εισάγεται κατόπιν σε ..........

Σκέψη / Μεθοδολογία: Ανακαλούμε με τη σειρά τους όρους που περιγράφηκαν στα §9.1-9.2: περιοριστική ενδονουκλεάση, φορέας κλωνοποίησης, DNA δεσμάση, mRNA, αντίστροφη μεταγραφάση, φορέας κλωνοποίησης, κύτταρο-ξενιστής (βακτήριο).

Απάντηση: Το DNA κόβεται με [περιοριστικές ενδονουκλεάσες] σε κομμάτια με γνωστά άκρα. Τα κομμάτια συνδέονται με έναν [φορέα κλωνοποίησης] (πλασμίδιο ή DNA φάγου), που έχει συμπληρωματικά άκρα, με τη βοήθεια ενός ενζύμου που λέγεται [DNA δεσμάση]. Το cDNA μπορεί να κατασκευαστεί από το [mRNA] με τη βοήθεια ενζύμου που ονομάζεται [αντίστροφη μεταγραφάση] και να συνδεθεί με έναν [φορέα κλωνοποίησης]. Το ανασυνδυασμένο μόριο εισάγεται κατόπιν σε [κύτταρο-ξενιστή (π.χ. βακτήριο)].

Άσκηση Ε6 (σελ. 69)

Ποια κύτταρα θα χρησιμοποιούσατε για να κατασκευάσετε μία cDNA βιβλιοθήκη, εάν θα θέλατε να συνθέσετε με τη μέθοδό αυτή; α. Ινσουλίνη β. Αιμοσφαιρίνη γ. Αντισώματα δ. Μυοσίνη.

Σκέψη / Μεθοδολογία: Η cDNA βιβλιοθήκη κατασκευάζεται από mRNA κυττάρων που ΕΚΦΡΑΖΟΥΝ το συγκεκριμένο γονίδιο — άρα διαλέγουμε τον ιστό/κυτταρικό τύπο όπου η κάθε πρωτεΐνη φυσιολογικά παράγεται.

Απάντηση: α. Ινσουλίνη → κύτταρα β (βήτα) του παγκρέατος (νησίδια Langerhans). β. Αιμοσφαιρίνη → πρόδρομα ερυθροκύτταρα (ερυθροβλάστες) του μυελού των οστών. γ. Αντισώματα → πλασματοκύτταρα (διαφοροποιημένα Β-λεμφοκύτταρα). δ. Μυοσίνη → κύτταρα μυϊκού ιστού (μυϊκές ίνες). Σε κάθε περίπτωση επιλέγουμε τον κυτταρικό τύπο που φυσιολογικά εκφράζει (μεταγράφει σε mRNA) το αντίστοιχο γονίδιο, αφού μόνο εκεί θα υπάρχει το κατάλληλο mRNA για να απομονωθεί και να χρησιμεύσει ως καλούπι για το cDNA.

Πρόσεξε:

• Το γονιδίωμα (DNA) είναι ίδιο σε όλα τα κύτταρα του οργανισμού — αυτό που διαφέρει ανά ιστό είναι ποια γονίδια ΕΚΦΡΑΖΟΝΤΑΙ (μεταγράφονται σε mRNA), και μόνο αυτά «πιάνει» μια cDNA βιβλιοθήκη.