Ποια συστατικά χρειάζονται για να παραχθεί ανθρώπινη ινσουλίνη από κύτταρα E. coli;
Σκέψη / Μεθοδολογία: Ανατρέχουμε στα στάδια παραγωγής ινσουλίνης του §13.1: χρειάζεται το κατάλληλο γενετικό υλικό (cDNA του γονιδίου), φορέα κλωνοποίησης και βακτηριακό κύτταρο-ξενιστή, καθώς και τα απαραίτητα ένζυμα για τη διαδικασία.
Απάντηση: Χρειάζονται: το cDNA (δίκλωνο DNA) που προκύπτει από το mRNA της (προ)ινσουλίνης, απομονωμένο από κύτταρα του ανθρώπινου παγκρέατος· ένα πλασμίδιο ως φορέας κλωνοποίησης, στο οποίο ενσωματώνεται το cDNA· κύτταρα E. coli, τα οποία μετασχηματίζονται με το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο, ώστε να «διαβάσουν» το ξένο γονίδιο και να παράγουν το πρόδρομο μόριο (προϊνσουλίνη)· και τέλος ένα κατάλληλο ένζυμο που μετατρέπει την προϊνσουλίνη σε ώριμη ινσουλίνη.
Πρόσεξε:
Σε ένα ευκαρυωτικό κύτταρο παράγεται ινσουλίνη: α. Σε ποια θέση στο κύτταρο γίνονται η μεταγραφή και η μετάφραση; β. Στη Γενετική Μηχανική η ινσουλίνη παράγεται από mRNA και όχι από DNA. Γιατί;
Σκέψη / Μεθοδολογία: α. Ανατρέχουμε στη γενική οργάνωση του ευκαρυωτικού κυττάρου. β. Σκεφτόμαστε τη διαφορά δομής ευκαρυωτικού/προκαρυωτικού γονιδίου (ύπαρξη εσωνίων) και τι θα συνέβαινε αν χρησιμοποιούνταν απευθείας το γονιδιωματικό DNA σε ένα βακτήριο.
Απάντηση: α. Σε ευκαρυωτικό κύτταρο, η μεταγραφή (παραγωγή του πρόδρομου mRNA και ωρίμανσή του) γίνεται στον πυρήνα, ενώ η μετάφραση (σύνθεση της πρωτεΐνης στα ριβοσώματα) γίνεται στο κυτταρόπλασμα. β. Το ανθρώπινο γονίδιο της ινσουλίνης, όπως τα περισσότερα ευκαρυωτικά γονίδια, περιέχει εσώνια (μη κωδικές αλληλουχίες) που αφαιρούνται μόνο κατά την ωρίμανση του mRNA μέσα στον πυρήνα. Το βακτήριο δεν διαθέτει τον μηχανισμό ωρίμανσης (αποκοπή εσωνίων), οπότε αν χρησιμοποιούνταν απευθείας το γονιδιωματικό DNA, θα παρήγαγε λανθασμένη πρωτεΐνη. Γι' αυτό στη Γενετική Μηχανική χρησιμοποιείται το ώριμο mRNA (χωρίς εσώνια), από το οποίο κατασκευάζεται με αντίστροφη μεταγραφή το cDNA — DNA χωρίς εσώνια, «κατανοητό» από το βακτηριακό μεταφραστικό μηχανισμό.
Πρόσεξε:
Αναφέρετε τα πλεονεκτήματα παραγωγής ανθρώπινης αυξητικής ορμόνης με μεθόδους Γενετικής Μηχανικής σε σχέση με την εξαγωγή της από πτώματα.
Σκέψη / Μεθοδολογία: Συγκρίνουμε τη «βιοτεχνολογική» παραγωγή (κατ' αναλογία με την ινσουλίνη, §13.1) με την παλιά μέθοδο εξαγωγής από ανθρώπινους ιστούς — σε ποσότητα, κόστος, καθαρότητα και ασφάλεια.
Απάντηση: Η παραγωγή με Γενετική Μηχανική επιτρέπει: (α) απεριόριστη, μεγάλη ποσότητα ορμόνης, χωρίς εξάρτηση από διαθέσιμο ανθρώπινο ιστό· (β) χαμηλότερο κόστος παραγωγής σε σχέση με τη δαπανηρή εξαγωγή από πτώματα· (γ) μεγαλύτερη καθαρότητα και ομοιογένεια του προϊόντος, με αυστηρό ποιοτικό έλεγχο· (δ) πολύ μεγαλύτερη ασφάλεια, αφού αποφεύγεται ο κίνδυνος μετάδοσης ασθενειών από τον ιστό-δότη (π.χ. η εξαγωγή αυξητικής ορμόνης από πτώματα συνδέθηκε ιστορικά με τη μετάδοση της νόσου Creutzfeldt-Jakob).
Πρόσεξε:
Η ινσουλίνη ήταν η πρώτη πρωτεΐνη που παρήχθη με μεθόδους Γενετικής Μηχανικής. Για ποιο λόγο νομίζετε ότι υπήρξε η πρώτη αυτή;
Σκέψη / Μεθοδολογία: Σκεφτόμαστε ποιοι παράγοντες κάνουν μια πρωτεΐνη «εύκολο» πρώτο στόχο: μέγεθος/απλότητα μορίου, μεγάλη κλινική ζήτηση, ύπαρξη ήδη γνωστής δομής.
Απάντηση (ενδεικτική): Η ινσουλίνη ήταν ιδανικός πρώτος στόχος γιατί: (α) είναι σχετικά μικρό μόριο (51 αμινοξέα σε δύο μόνο πεπτίδια), εύκολο στην κλωνοποίηση και έκφραση σε βακτήρια σε σχέση με μεγαλύτερες, πολυπλοκότερες πρωτεΐνες· (β) η δομή και η λειτουργία της ήταν ήδη καλά γνωστές από τη μελέτη του διαβήτη πολύ πριν την ανάπτυξη της Γενετικής Μηχανικής· (γ) υπήρχε τεράστια και επείγουσα κλινική ανάγκη, αφού εκατομμύρια διαβητικοί εξαρτιόνταν από ακριβή, περιορισμένης διαθεσιμότητας ζωική ινσουλίνη με κίνδυνο αλλεργικών αντιδράσεων — επομένως και ισχυρό οικονομικό/ερευνητικό κίνητρο για την ανάπτυξη της νέας μεθόδου.
Πρόσεξε: